Monkeypox Virus Real Time PCR Kit

1. SampolKoleksyon:Ang ispesimen ay dapat kolektahin sa mga sterile na tubo alinsunod

na may karaniwang teknikal na mga pagtutukoy.

2. Paghahanda ng Reagent (Lugar ng Paghahanda ng Reagent)

Ilabas ang mga bahagi ng kit, balansehin ang mga ito sa temperatura ng kuwarto para sa standby na paggamit.

3. Pagproseso ng Ispesimen (Lugar ng Pagproseso ng Ispesimen)

3.1 Pagkuha ng nucleic acid

Inirerekomenda na kumuha ng 200μL liquid sample, Positive Control at Negative Control para sa nucleic acid extraction, ayon sa kaukulang mga kinakailangan at pamamaraan ng viral DNA extraction kit.

3.2 Lyophilized powder dissolving at pagdaragdag ng template

Maghanda ng Monkeypox Virus Lyophilized premix ayon sa bilang ng mga sample.Ang isang sample ay nangangailangan ng isang PCR tube na naglalaman ng Lyophilized premix powder.Ang negatibong kontrol at positibong kontrol ay dapat ituring bilang dalawang sample.

(1) Magdagdag ng 15μL Dissolving Solution sa bawat PCR tube na naglalaman ng Lyophilized premix, pagkatapos ay magdagdag ng 5μL extracted samples/ Negative Control/Positive Control sa bawat PCR tube ayon sa pagkakabanggit.

(2) Takpan nang mahigpit ang mga PCR tubes, i-flick ang PCR tubes sa pamamagitan ng kamay hanggang ang lyophilized powder ay ganap na matunaw at maghalo, kolektahin ang likido sa ilalim ng PCR tubes sa pamamagitan ng instant na low-speed centrifugation.

(3) Kung gumagamit ng karaniwang Real-time na PCR instrument para sa pagtuklas, pagkatapos ay direktang ilipat ang mga PCR tube sa lugar ng amplification;kung gagamit ng BTK-8 para sa pagtuklas, pagkatapos ay kailangang gawin ang mga sumusunod na operasyon: ilipat ang 10 μL na likido mula sa PCR tube patungo sa reaction chip well ng BTK-8.Ang isang PCR tube ay tumutugma sa isang balon sa chip.Sa panahon ng pagpapatakbo ng pipetting, siguraduhin na ang pipette ay 90 degrees patayo.Ang mga tip sa pipette ng aerosol barrier ay dapat ilagay sa gitna ng balon nang may katamtamang puwersa at itigil ang pagtulak ng pipette kapag naabot na nito ang unang gear (upang maiwasan ang mga bula).Pagkatapos mapuno ang mga balon, kumuha ng isang reaction chip membrane upang takpan ang lahat ng mga balon at ang chip ay pagkatapos ay ililipat sa lugar ng pagtuklas ng amplification.

4. PCR Amplification (Detection Area)

4.1 Ilagay ang PCR tubes/reaction chip sa reaction tank at itakda nang maayos ang mga pangalan ng bawat reaksyon sa kaukulang pagkakasunud-sunod.

4.2 Mga setting ng detection fluorescence: (1) Monkeypox virus (FAM);(2) Panloob na Kontrol (CY5).

4.3 Patakbuhin ang sumusunod na cycling protocol

Protocol ng ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protocol ng BTK-8:

5. Pagsusuri ng mga resulta (mangyaring sumangguni sa Manwal ng Gumagamit ng Instrumento）

Pagkatapos ng reaksyon, awtomatikong mase-save ang mga resulta.I-click ang “Analyze” para suriin, at awtomatikong bibigyang-kahulugan ng instrumento ang mga Ct value ng bawat sample sa column ng resulta.Ang mga negatibo at positibong resulta ng kontrol ay dapat sumunod sa sumusunod na "6. Quality Control ".

6. Kontrol sa Kalidad

6.1 Negatibong Kontrol: Walang Ct o Ct>40 sa FAM channel, Ct≤40 sa CY5 channel na may normal na amplification curve.

6.2 Positibong Kontrol: Ct≤35 sa FAM channel na may normal na amplification curve, Ct≤40 sa CY5 channel na may normal na amplification curve.

6.3 Ang resulta ay wasto kung ang lahat ng pamantayan sa itaas ay natugunan.Kung hindi, ang resulta ay hindi wasto.

Interpretasyon ng Resulta

Posible ang mga sumusunod na resulta:

TANDAAN: Kung mangyari ang hindi wastong resulta, kailangang kolektahin at subukang muli ang sample.